ANEXO I

M閠odos de toma de muestras para el control oficial de los niveles de dioxinas (PCDD/PCDF) y la determinaci髇 de PCB similares a las dioxinas en determinados productos alimenticios

1. Objeto y 醡bito de aplicaci髇

Las muestras destinadas al control oficial de los niveles de dioxinas (PCDD/PCDF), as� como a la determinaci髇 del contenido de PCB (1) similares a las dioxinas en los productos alimenticios, se tomar醤 de conformidad con los m閠odos descritos a continuaci髇. Las muestras globales as� obtenidas se considerar醤 representativas de los lotes o sublotes de los que se obtengan.

El cumplimiento de lo establecido en el Reglamento (CE) n.� 466/2001, por el que se fija el contenido m醲imo de determinados contaminantes en los productos alimenticios, se determinar� en funci髇 de los niveles hallados en las muestras de laboratorio.

2. Definiciones

• a) Lote: cantidad de producto alimenticio identificable, entregada en una misma vez y que presenta, a juicio del agente responsable, caracter韘ticas comunes, tales como el origen, la variedad, el tipo de embalaje, el envasador, el expedidor o el etiquetado.

  En el caso del pescado y de los productos pesqueros tambi閚 deber� ser comparable su tama駉.

• b) Sublote: parte designada de un gran lote, para aplicar sobre ella el m閠odo de toma de muestras. Cada sublote deber� estar separado f韘icamente y ser identificable.
• c) Muestra elemental: cantidad de material tomado en un 鷑ico punto del lote o sublote.
• d) Muestra global: el total combinado de todas las muestras elementales tomadas del lote o sublote.
• e) Muestra de laboratorio: una parte/cantidad representativa de la muestra global destinada al laboratorio.

Cong閚eres	Valor FET	Cong閚eres	Valor FET
Dibenzo-p-dioxinas (玃CDD�)		PCB 玸imilares a las dioxinas�	PCB no-orto +
2,3,7,8-TCDD	1	PCB mono-orto
1,2,3,7,8-PeCDD	1	PCB no-orto
1,2,3,4,7,8-HxCDD	0,1	PCB 77	0,0001
1,2,3,6,7,8-HxCDD	0,1	PCB 81	0,0001
1,2,3,7,8,9-HxCDD	0,1	PCB 126	0,1
1,2,3,4,6,7,8-HpCDD	0,01	PCB 169	0,01
OCDD	0,0001
Dibenzofuranos (玃CDF�)		PCB mono-orto
2,3,7,8-TCDF	0,1	PCB 105	0,0001
1,2,3,7,8-PeCDF	0,05	PCB 114	0,0005
2,3,4,7,8-PeCDF	0,5	PCB 118	0,0001
1,2,3,4,7,8-HxCDF	0,1	PCB 123	0,0001
1,2,3,6,7,8-HxCDF	0,1	PCB 156	0,0005
1,2,3,7,8,9-HxCDF	0,1	PCB 157	0,0005
2,3,4,6,7,8-HxCDF	0,1	PCB 167	0,00001
1,2,3,4,6,7,8-HpCDF	0,01	PCB 189	0,0001
1,2,3,4,7,8,9-HpCDF	0,01
OCDF	0,0001

Abreviaturas utilizadas: T = tetra; Pe = penta; Hx = hexa Hp = hepta; O = octo

CDD = Clorodibenzodioxina; CDF = Clorodibenzofurano; CB = clorobifenilo

3. Disposiciones generales

3.1 Autoridad competente.

El Ministerio de Sanidad y Consumo para el comercio extracomunitario y los 髍ganos competentes de las comunidades aut髇omas para el mercado interior, sin perjuicio, en este 鷏timo caso, de las competencias del Ministerio de Defensa cuando las disposiciones de este real decreto afecten a unidades, centros u 髍ganos militares.

3.2 Personal.

La toma de muestras debe ser efectuada por personal autorizado a tal efecto por las autoridades competentes.

3.3 Muestreo del producto.

Todo lote para analizar ser� objeto de un muestreo separado.

3.4 Precauciones.

Durante el muestreo y la preparaci髇 de las muestras de laboratorio, deber醤 tomarse precauciones con el fin de evitar toda alteraci髇 que pueda modificar el contenido en dioxinas y PCB similares a las dioxinas, o afectar a los an醠isis o a la representatividad de la muestra global.

3.5 Muestras elementales.

En la medida de lo posible, las muestras elementales se tomar醤 en distintos puntos del lote o sublote. Toda excepci髇 a esta norma deber� se馻larse en el acta contemplada en el apartado 3.9.

3.6 Preparaci髇 de la muestra global.

La muestra global se obtiene por mezcla de todas las muestras elementales. Deber� pesar al menos 1 kg, a menos que no sea posible, por ejemplo, cuando s髄o se haya tomado muestra de un envase.

3.7 Subdivisi髇 de la muestra global en muestras de laboratorio.

Las muestras de laboratorio se tomar醤 de la muestra global homogeneizada, a efectos comerciales, de arbitraje o de control oficial, para la realizaci髇 de los an醠isis inicial, contradictorio y dirimente, seg鷑 lo establecido en el Real Decreto 1945/1983, de 22 de junio, por el que se regulan las infracciones y sanciones en materia de defensa del consumidor y de la producci髇 agroalimentaria, y dem醩 disposiciones que resulten de aplicaci髇 en cada caso.

El tama駉 de las muestras de laboratorio susceptibles de servir a efectos de control oficial ser� suficiente para que puedan hacerse al menos dos an醠isis.

3.8 Acondicionamiento y env韔 de las muestras globales y de laboratorio.

Cada muestra global y cada muestra de laboratorio deber� colocarse en un recipiente limpio, de material inerte, que ofrezca protecci髇 adecuada contra todo factor de contaminaci髇, contra la p閞dida de analitos por adsorci髇 a la pared interna del contenedor y contra todo da駉 que pudiera ocasionar el transporte. Han de tomarse tambi閚 todas las precauciones necesarias para evitar cualquier modificaci髇 de la composici髇 de las muestras globales y de laboratorio que pudiera ocurrir durante el transporte o el almacenamiento.

3.9 Cierre y etiquetado de las muestras globales y de laboratorio.

Cada muestra oficial se sellar� en el lugar del muestreo y se identificar� seg鷑 lo dispuesto en el Real Decreto 1945/1983 y dem醩 disposiciones que resulten de aplicaci髇 en cada caso. En cada toma de muestras, se cumplimentar� un acta de muestreo que permita identificar sin ambig黣dad el lote e identificar la fecha y el lugar del muestreo, as� como toda informaci髇 adicional que pueda resultar 鷗il al analista.

4. Planes de muestreo

El m閠odo de muestreo utilizado garantizar� que la muestra global sea representativa del lote que vaya a controlarse.

N鷐ero de muestras elementales

En el caso de la leche y los aceites, para los que se supone una distribuci髇 homog閚ea de los contaminantes en cuesti髇 en un lote determinado, bastar� con tomar tres muestras elementales para cada lote que forme la muestra global. Deber� indicarse el n鷐ero de lote. Para los dem醩 productos, el n鷐ero m韓imo de muestras elementales que deben tomarse del lote ser� el indicado en el cuadro 1.

El peso de la muestra global, que incluye todas las muestras elementales, deber� ser de al menos 1 kg, conforme a lo indicado en el apartado 3.6. Las muestras elementales ser醤 de un peso similar. El peso de la muestra elemental deber� ser de al menos 100 gramos, y depende del tama駉 de las part韈ulas del lote. Toda excepci髇 a esta norma debe se馻larse en el acta contemplada en el apartado 3.9. Con arreglo a lo dispuesto en la Decisi髇 97/747/CE de la Comisi髇, de 27 de Octubre de 1997, por la que se fijan los niveles y frecuencias de muestreo, previstas en el Real Decreto 1749/1998, de 31 de julio, por el que se establecen las medidas de control aplicables a determinadas sustancias y sus residuos en los animales vivos y sus productos, con vistas al control de determinadas sustancias y sus residuos en determinados productos animales (1), el tama駉 de la muestra para los huevos de gallina es de 12 huevos o m醩 (para lotes a granel, as� como para paquetes individuales conforme a lo indicado en los cuadros 1 y 2).

CUADRO 1 N鷐ero m韓imo de muestras elementales que deben tomarse del lote

Peso del lote (expresado en kg)	N鷐ero m韓imo de muestras elementales que deben tomarse
< 50	3
50 a 500	5
> 500	10

Si el lote est� formado por envases individuales, el n鷐ero de envases que han de tomarse para formar la muestra global se indica en el cuadro 2.

CUADRO 2 N鷐ero de envases (muestras elementales) que deben tomarse para formar una muestra global si el lote est� formado por envases individuales

N鷐ero de envases o unidades del lote	N鷐ero de envases o unidades que deben tomarse
1 a 25	1 envase o unidad
26 a 100	Un 5 %, un m韓imo de 2 envases o unidades
> 100	Un 5 %, como m醲imo 10 envases o unidades

• a) Disposiciones espec韋icas para el muestreo de lotes que contengan peces enteros.

  El n鷐ero de muestras elementales que deber醤 tomarse del lote se define en el Cuadro 1. La muestra global resultante de la mezcla de todas las muestras elementales deber� ser de un m韓imo de 1 Kg, seg鷑 lo regulado en el apartado 3.6 de este anexo.

  En el caso de que el lote objeto de muestreo contenga peces peque駉s (cada uno con un peso inferior a 1 Kg), se tomar� el pez entero como muestra elemental para formar la muestra global. Cuando la muestra global resultante pese m醩 de 3 Kg, las muestras elementales podr醤 tomarse de la parte media de los peces que formen la muestra global, y tendr醤 un peso m韓imo de 100 gramos.

  La porci髇 que debe homogeneizarse ser� la que tiene establecido el l韒ite m醲imo, que es la carne de pescado (m鷖culo) para la mayor韆 de los peces y las piezas 韓tegras para los peces que se consumen enteros.

  En el caso de que el lote objeto de muestreo contenga peces de mayor tama駉 (cada uno con un peso superior a 1 Kg), la muestra elemental se tomar� de la parte media del pez. Cada muestra elemental deber� pesar como m韓imo 100 gramos. Cuando el lote objeto de muestreo contenga peces de muy gran tama駉 (por ejemplo > 6 Kg) y la extracci髇 de un trozo de la parte media del pez provoque una importante p閞dida econ髆ica, podr� considerarse suficiente la toma de tres muestras elementales con un peso m韓imo de 350 gramos cada una, con independencia del tama駉 del lote.

• Subapartado final del n鷐ero 4 del Anexo I introducido por O.M. SCO/3767/2004, de 10 de noviembre, por la que se modifican los anexos I y II del R.D. 604/2003, de 23 de mayo, por el que se establecen los m閠odos de toma de muestras y de an醠isis para el control oficial de las dioxinas y la determinaci髇 de policlorobifenilos (PCB) similares a las dioxinas en los productos alimenticios (獴.O.E.� 18 noviembre).Vigencia: 19 noviembre 2004

5. Conformidad del lote o sublote con la especificaci髇.

El lote se aceptar� si el resultado anal韙ico de un 鷑ico an醠isis no supera el l韒ite m醲imo respectivo establecido en la Secci髇 5 del Reglamento (CE) n.� 466/2001, de 8 de marzo, por el que se fija el contenido m醲imo de determinados contaminantes en los productos alimenticios, teniendo en cuenta la incertidumbre de la medida.

Se considerar� que el lote incumple el l韒ite m醲imo establecido en la Secci髇 5 del Reglamento (CE) n.� 466/2001 si el resultado anal韙ico confirmado por el an醠isis por duplicado y calculado como media de un m韓imo de dos determinaciones independientes supera dicho l韒ite m醲imo fuera de toda duda razonable teniendo en cuenta la incertidumbre de la medida.

La incertidumbre de la medida podr� tenerse en cuenta con arreglo a uno de los enfoques siguientes:

calculando la incertidumbre expandida mediante la utilizaci髇 de un factor de cobertura de 2, lo que da un nivel de confianza del 95% aproximadamente;

estableciendo el l韒ite de decisi髇 (CCα) con arreglo a lo regulado en el apartado 3.1.2.5 del Anexo de la Decisi髇 2002/657/CE de la Comisi髇, de 12 de agosto de 2002, por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los m閠odos anal韙icos y la interpretaci髇 de los resultados (en el caso de las sustancias para las que se ha establecido un nivel permitido).

Estas normas interpretativas se aplicar醤 al resultado anal韙ico obtenido de la muestra global destinada al control oficial.

ANEXO II

Preparaci髇 de las muestras y criterios que deben cumplir los m閠odos de an醠isis utilizados en el control oficial de los niveles de dioxinas (PCDD/PCDF) y en la determinaci髇 de PCB similares a las dioxinas en determinados productos alimenticios

1. Objeto y 醡bito de aplicaci髇

Estos requisitos deber醤 aplicarse en el an醠isis de los productos alimenticios realizado a efectos del control oficial del nivel de dioxinas [dibenzo-p-dioxinas policloradas (PCDD) y dibenzofuranos policlorados (PCDF)] y de la determinaci髇 de PCB similares a las dioxinas.

El control de la presencia de dioxinas en los productos alimenticios puede efectuarse mediante una estrategia que incluya un m閠odo de detecci髇 selectiva, a fin de seleccionar las muestras cuyo contenido en dioxinas y PCB similares a las dioxinas sea menos de un 30-40 % inferior al nivel considerado o exceda de dicho nivel. El contenido de dioxinas en esas muestras deber� determinarse/confirmarse mediante un m閠odo de confirmaci髇.

Los m閠odos de detecci髇 selectiva son los que se utilizan para detectar la presencia de dioxinas y PCB similares a dioxinas en el nivel considerado. Estos m閠odos se caracterizan por su capacidad de analizar un elevado n鷐ero de muestras en poco tiempo, con el fin de detectar posibles positivos. Est醤 espec韋icamente dise馻dos para evitar resultados falsos negativos.

Son m閠odos de confirmaci髇 los que proporcionan una informaci髇 completa o complementaria que permite la identificaci髇 y cuantificaci髇 inequ韛oca de las dioxinas y los PCB similares a las dioxinas en el nivel considerado.

2. Contexto

Habida cuenta de que las muestras ambientales y biol骻icas (incluidas las muestras de productos alimenticios) contienen, por lo general, mezclas complejas de diferentes cong閚eres de dioxinas, se ha desarrollado el concepto de factores de equivalencia t髕ica (FET) a fin de facilitar la evaluaci髇 de los riesgos. Estos FET permiten expresar concentraciones de mezclas PCDD y PCDF sustituidos en posiciones 2,3,7 y 8, y, m醩 recientemente, de algunas formas de PCB con cloros sustituidos en posiciones no-orto y mono-orto que presentan una actividad similar a las dioxinas en equivalentes t髕icos (EQT) de 2,3,7,8-TCDD, seg鷑 se indica en la nota 1 del anexo I.

Las concentraciones de cada sustancia en una muestra dada se multiplican por sus respectivos FET y se suman a continuaci髇 para obtener la concentraci髇 total de compuestos similares a dioxinas expresados en EQT.

El concepto de 玪韒ite superior� exige la utilizaci髇 del l韒ite de cuantificaci髇 para la contribuci髇 de cada cong閚ere no cuantificado al EQT.

El concepto de 玪韒ite inferior� exige la utilizaci髇 de cero para la contribuci髇 de cada cong閚ere no cuantificado al EQT.

El concepto de 玪韒ite intermedio� exige la utilizaci髇 de la mitad del l韒ite de cuantificaci髇 para calcular la contribuci髇 de cada cong閚ere no cuantificado al EQT.

Exclusivamente a efectos de la presente Orden, el l韒ite espec韋ico aceptado de cuantificaci髇 de un cong閚ere individual ser� la concentraci髇 de un analito en el extracto de una muestra que produzca una respuesta instrumental a dos iones diferentes, que se controlar� con una relaci髇 se馻l/ruido (SR) de 3:1 para la se馻l menos sensible y el cumplimiento de requisitos b醩icos tales como, por ejemplo, el tiempo de retenci髇 y la relaci髇 isot髉ica con arreglo al procedimiento de determinaci髇 descrito en el m閠odo EPA 1613, revisi髇 B. P醨rafo 6.� del apartado 2 del Anexo II introducido por O.M. SCO/3767/2004, de 10 de noviembre, por la que se modifican los anexos I y II del R.D. 604/2003, de 23 de mayo, por el que se establecen los m閠odos de toma de muestras y de an醠isis para el control oficial de las dioxinas y la determinaci髇 de policlorobifenilos (PCB) similares a las dioxinas en los productos alimenticios (獴.O.E.� 18 noviembre).Vigencia: 19 noviembre 2004

3. Requisitos de garant韆 de calidad que han de cumplirse en la preparaci髇 de las muestras

a) Deber醤 tomarse las medidas pertinentes para evitar la contaminaci髇 cruzada de cada fase del procedimiento de toma de muestras y de an醠isis.

b) Las muestras deber醤 ser almacenadas y transportadas en recipientes de vidrio, aluminio, polipropileno o polietileno. Deber醤 eliminarse del recipiente que contiene la muestra los restos de polvo de papel. Los recipientes de vidrio deber醤 lavarse con disolventes previamente sometidos a un control de detecci髇 de dioxinas.

c) El almacenamiento y el transporte de las muestras deber� realizarse de modo que se preserve la integridad de la muestra de producto alimenticio.

d) En la medida en que sea pertinente, cada muestra de laboratorio deber� triturarse finamente y mezclarse minuciosamente utilizando un procedimiento reconocido que garantice una homogeneizaci髇 completa (por ejemplo, trituraci髇 que permita pasar a trav閟 de un tamiz de 1 mm); en caso de que el contenido de humedad sea demasiado elevado, las muestras deber醤 secarse antes de proceder a su trituraci髇.

e) Efectuar un an醠isis en blanco, para lo cual se realizar� todo el procedimiento anal韙ico omitiendo 鷑icamente la muestra.

f) El peso de la muestra utilizada para la extracci髇 deber� ser el suficiente para que se cumplan los requisitos relativos a la sensibilidad.

g) Existen muchos procedimientos espec韋icos para la preparaci髇 de muestras que son satisfactorios y pueden utilizarse para los productos considerados. Los procedimientos deber醤 ser validados con arreglo a las directrices aceptadas internacionalmente.

4. Requisitos que deben cumplir los laboratorios

a) Los laboratorios deber醤 demostrar la eficacia de un m閠odo en el nivel considerado, por ejemplo, 0,5, 1 y 2 veces el nivel considerado con un coeficiente de variaci髇 aceptable para an醠isis repetidos. Por lo que se refiere a los criterios de validez, v閍se el apartado 5.

b) El l韒ite de cuantificaci髇 en un m閠odo de confirmaci髇 deber� situarse en un intervalo de aproximadamente un quinto del nivel considerado, a fin de garantizar coeficientes de variaci髇 aceptables en el intervalo de referencia.

c) Como medidas internas de garant韆 de calidad, deber醤 realizarse regularmente controles en blanco y experimentos con muestras enriquecidas o an醠isis de muestras de control (de preferencia, si existe, material de referencia certificado).

d) La participaci髇 con 閤ito en estudios entre laboratorios que eval鷄n la competencia del laboratorio es la mejor manera de demostrar la aptitud de 閟te para efectuar an醠isis espec韋icos. No obstante, la participaci髇 con 閤ito en estudios entre laboratorios cuando se trata, por ejemplo, de muestras de suelos o de aguas residuales no prueba necesariamente la competencia en el 醡bito de las muestras de alimentos o piensos, que presentan niveles de contaminaci髇 m醩 bajos. Por lo tanto, la participaci髇 continua en estudios entre laboratorios para la detecci髇 de dioxinas y PCB similares a las dioxinas en las matrices de alimentos/piensos es obligatoria.

e) De conformidad con lo dispuesto en el Real Decreto 1397/1995, de 4 de agosto, por el que se aprueban medidas adicionales sobre el control oficial de los productos alimenticios, los laboratorios deber醤 estar acreditados por un organismo reconocido que opere de conformidad con la Gu韆 ISO 58, a fin de garantizar que cumplen la garant韆 de calidad anal韙ica. Dicha acreditaci髇 debe ser conforme a la norma ISO/IEC/17025:1999.

5. Requisitos para los procedimientos anal韙icos aplicables a las dioxinas y los PCB similares a las dioxinas

Requisitos b醩icos de aceptaci髇 de los procedimientos anal韙icos:

• a) Sensibilidad elevada y l韒ites de detecci髇 bajos. En el caso de los PCDD y PCDF, los umbrales de detecci髇 deben situarse en el picogramo EQT (10^-12 g), habida cuenta de la extrema toxicidad de algunos de estos compuestos. Se sabe que los PCB suelen presentarse en cantidades m醩 elevadas que los PCDD y PCDF. Para la mayor韆 de los cong閚eres del grupo de los PCB, es suficiente una sensibilidad en el intervalo de nanogramos (10^-9 g). No obstante, para medir los cong閚eres de PCB similares a las dioxinas m醩 t髕icos (en particular, los cong閚eres sustituidos no-orto) es preciso conseguir la misma sensibilidad que para los PCDD y los PCDF.
• b) Selectividad elevada (especificidad). Es necesario establecer una distinci髇 entre los PCDD, los PCDF y los PCB similares a las dioxinas, y una multitud de otros compuestos extra韉os simult醤eamente de la muestra, capaces de interferir, y que est醤 presentes en concentraciones de hasta varios 髍denes de magnitud superiores a las de los anal韙icos considerados. Por lo que respecta a los m閠odos de cromatograf韆 de gases/ espectrometr韆 de masas (GC/MS), es necesario distinguir entre varios cong閚eres, en particular entre los t髕icos (es decir, los diecisiete PCDD y PCDF sustituidos en 2,3,7 y 8 y los PCB similares a las dioxinas) y otros cong閚eres. Los bioensayos deber韆n permitir una determinaci髇 selectiva de los valores EQT como suma de PCDD, PCDF y PCB similares a las dioxinas.
• c) Exactitud elevada (veracidad y precisi髇). La determinaci髇 deber韆 proporcionar una estimaci髇 v醠ida de la concentraci髇 real en una muestra. A fin de evitar que el resultado del an醠isis de una muestra sea rechazado debido a la escasa fiabilidad de la estimaci髇 de EQT, es necesario lograr un alto grado de exactitud (exactitud de la medici髇; grado de concordancia entre el resultado de la medici髇 y el valor real o atribuido a la medici髇). La exactitud se expresa como veracidad (diferencia entre el valor medio medido para un analito en un material certificado y su valor certificado, expresado en porcentaje de dicho valor) y como precisi髇 (la precisi髇 suele calcularse como desviaci髇 t韕ica; incluye la repetibilidad y reproducibilidad e indica la diferencia entre los resultados obtenidos aplicando varias veces el procedimiento experimental en condiciones establecidas).

  Los m閠odos de cribado pueden incluir bioensayos y m閠odos GC/MS; los m閠odos de confirmaci髇 son m閠odos de cromatograf韆 de gases de alta resoluci髇/espectometr韆 de masas de alta resoluci髇 (HRGC/HRMS). Deben cumplirse los siguientes criterios para el valor EQT total:

  	M閠odos de cribado	M閠odos de confirmaci髇
  Porcentaje de falsos negativos	< 1 %
  Veracidad		- 20% a + 20 %
  CV (coeficiente de variaci髇)	< 30 %	< 15 %

6. Requisitos espec韋icos que deben cumplir los m閠odos CG/MS utilizados con fines de cribado o de confirmaci髇

a) A fin de validar el procedimiento anal韙ico, es preciso a馻dir patrones internos de PCDD/F marcados con ¹³C y con cloros sustituidos en 2,3,7 y 8 (y patrones internos de PCB similares a las dioxinas marcados con ¹³C, cuando sea necesario determinar los PCB similares a las dioxinas) desde el inicio o antes de comenzar el m閠odo anal韙ico, por ejemplo previamente a la fase de extracci髇. Deber� a馻dirse al menos un cong閚ere para cada grupo hom髄ogo de PCDD/F tetra a octoclorados (y al menos un cong閚ere para cada uno de los grupos hom髄ogos de PCB similares a las dioxinas, cuando sea necesario determinar los PCB similares a las dioxinas) (alternativamente, deber� utilizarse para el control de PCDD/F y de PCB similares a las dioxinas al menos un cong閚ere para cada funci髇 de registro de iones seleccionados para la espectrometr韆 de masas). Se recomienda utilizar, sobre todo en los m閠odos de confirmaci髇, el conjunto de los diecisiete patrones internos de PCDD/F sustituidos en 2,3,7 y 8 y marcados con ¹³C, as� como la totalidad de los doce patrones internos de PCB similares a las dioxinas marcados con ¹³C (en caso de que sea necesario determinar los PCB similares a las dioxinas).

Habr醤 de determinarse asimismo los factores de respuesta relativos en el caso de los cong閚eres para los que no se a馻de ning鷑 an醠ogo marcado con ¹³C, mediante la utilizaci髇 de soluciones de calibraci髇 apropiadas.

b) Para los productos alimenticios de origen vegetal y los productos alimenticios de origen animal con un contenido de grasa inferior al 10 %, es obligatorio a馻dir patrones internos antes de proceder a la extracci髇. Por lo que respecta a los productos alimenticios de origen animal con un contenido de grasa superior al 10 %, los patrones internos podr醤 a馻dirse antes de la fase de extracci髇 o despu閟 de la extracci髇 de grasas. Conviene validar adecuadamente la eficacia de la extracci髇, en funci髇 de la fase en la que se introduzcan los patrones internos y si los resultados notificados se refieren al producto o a las grasas.

c) Previamente al an醠isis mediante CG/MS, deber醤 a馻dirse uno o dos patrones de recuperaci髇 (sustituto).

d) Es preciso realizar un control de recuperaci髇. Para los m閠odos de confirmaci髇, los porcentajes de recuperaci髇 de cada patr髇 interno deber醤 situarse en un intervalo del 60 % al 120 %. En el caso de cong閚eres individuales, en particular para algunas dibenzodioxinas y dibenzofuranos hepta y octoclorados, podr韆n aceptarse porcentajes de recuperaci髇 inferiores o superiores, siempre y cuando su contribuci髇 al valor EQT no supere el 10 % del valor total de EQT (teniendo 鷑icamente en cuenta los PCDD/F). Para los m閠odos de cribado los porcentajes de recuperaci髇, deber醤 situarse en un intervalo del 30 % al 140 %.

e) Es conveniente separar las dioxinas de los compuestos clorados interferentes, tales como los PCB y los 閠eres difen韑icos clorados, mediante t閏nicas de cromatograf韆 adecuadas (de preferencia con una columna de florisil, al鷐ina y/o carbono).

La separaci髇 de los is髆eros por cromatograf韆 de gases deber韆 ser suficiente (< 25 % de pico a pico entre 1,2,3,4,7,8-HxCDF y 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

f) La determinaci髇 deber� realizarse con arreglo al m閠odo EPA 1613, revisi髇 B: dioxinas y furanos tetra a octoclorados por diluci髇 de is髏opos con HRGC/HRMS u otro m閠odo con criterios de realizaci髇 equivalentes.

g) La diferencia entre el l韒ite superior y el l韒ite inferior de determinaci髇 no debe exceder el 20 % para los productos alimenticios cuya contaminaci髇 por dioxinas sea de aproximadamente 1 pg EQT-OMS/g grasa (teniendo 鷑icamente en cuenta los PCDD/PCDF). En el caso de los productos alimenticios con bajo contenido de grasa, deber醤 aplicarse los mismos requisitos para niveles de contaminaci髇 del orden de 1 pg EQT-OMS/g de producto. Para niveles de contaminaci髇 inferiores, por ejemplo 0,50 pg de producto EQT-OMS/g, la diferencia entre el l韒ite superior y el l韒ite inferior podr� situarse en un intervalo del 25 % al 40 %.

7. M閠odos anal韙icos de detecci髇 selectiva

7.1 Introducci髇.

Es posible aplicar distintos enfoques anal韙icos en un m閠odo de detecci髇 selectiva: un enfoque exclusivamente de cribado y un enfoque cuantitativo.

T閏nica de cribado

La respuesta de las muestras se compara con la de una muestra de referencia en el nivel considerado. Las muestras cuya respuesta es inferior a la de la muestra de referencia se consideran negativas, y las muestras cuya respuesta es superior se consideran positivas. Requisitos:

• 1.� En cada serie de ensayos deber醤 utilizarse blancos y muestras de referencia, extra韉as y analizadas al mismo tiempo y en condiciones id閚ticas. La respuesta de la muestra de referencia debe ser claramente superior a la del blanco.
• 2.� Deber醤 incluirse otras muestras de referencia con una concentraci髇 equivalente a 0,5 veces y 2 veces el nivel considerado, a fin de demostrar la eficacia del ensayo en el intervalo de referencia para el control del nivel considerado.
• 3.� Cuando se analicen otras matrices, deber� demostrarse la validez de las muestras de referencia, utilizando con preferencia muestras cuya concentraci髇 en EQT, establecida mediante un m閠odo HRGC/HRMS, sea similar a la de la muestra de referencia o, en su defecto, de un blanco enriquecido hasta concentraciones del mismo orden.
• 4.� Puesto que en los bioensayos no pueden utilizarse patrones internos, las pruebas de repetibilidad son muy importantes para obtener datos sobre la desviaci髇 t韕ica en una serie de ensayos. El coeficiente de variaci髇 debe ser inferior al 30 %.
• 5.� En el caso de los bioensayos, deber醤 identificarse claramente los compuestos diana, las posibles interferencias y los niveles m醲imos tolerables de blanco.

Enfoque cuantitativo

El enfoque cuantitativo exige varias series de diluciones del patr髇, procesos de limpieza y mediciones dobles o triples, as� como ensayos en blanco y controles de recuperaci髇. El resultado podr� expresarse en EQT, dando por sentado que los compuestos responsables de la se馻l cumplen el principio de EQT. Para ello, puede utilizarse el TCDD (o una mezcla de patrones de dioxinas/furanos), a fin de producir una curva de calibraci髇 que permita calcular el nivel de EQT en el extracto y, por lo tanto, en la muestra. A continuaci髇, este resultado se corrige con el nivel de EQT calculado para un blanco (para tener en cuenta las impurezas procedentes de los disolventes o productos qu韒icos utilizados) y para la recuperaci髇 (calculada a partir del nivel de EQT en una muestra de control de calidad pr髕ima al l韒ite considerado). Es fundamental tener en cuenta que parte de la p閞dida de recuperaci髇 aparente puede deberse a efectos matriciales y/o a diferencias entre los valores de FET en los bioensayos y los valores oficiales de FET definidos por la OMS.

7.2 Requisitos aplicables a los m閠odos anal韙icos de cribado.

• 1.� El cribado puede realizarse utilizando m閠odos anal韙icos GC/MS o bioensayos. Para los m閠odos GC/MS deben utilizarse los criterios establecidos en el apartado 6. Por lo que se refiere a los bioensayos celulares y los bioensayos realizados con kits, los requisitos espec韋icos aplicables figuran, respectivamente, en los apartados 7.3 y 7.4.
• 2.� Es necesario proporcionar informaci髇 sobre el n鷐ero de resultados falsos positivos y falsos negativos obtenidos para una amplia serie de muestras por debajo y por encima del nivel m醲imo o umbral de intervenci髇, en comparaci髇 con el contenido en EQT determinado mediante un m閠odo anal韙ico de confirmaci髇. Los porcentajes reales de falsos negativos deben ser inferiores al 1 %. La tasa de falsas muestras positivas debe ser lo suficientemente baja para que el m閠odo de cribado resulte eficaz.
• 3.� Los resultados positivos deber醤 confirmarse siempre mediante un m閠odo anal韙ico de confirmaci髇 (HRGC/HRMS). Adem醩, las muestras correspondientes a una amplia gama de EQT deber醤 ser confirmadas por un m閠odo HRGC/HRMS (aproximadamente del 2 % al 10 % de las muestras negativas). Deber� facilitarse informaci髇 sobre la correspondencia entre los resultados de los bioensayos y los del m閠odo HRGC/HRMS.

7.3 Requisitos espec韋icos aplicables a los bioensayos celulares.

• 1.� Cuando se efect鷈 un bioensayo, deber� utilizarse en cada prueba una serie de concentraciones de referencia de TCDD o una mezcla de dioxinas/furanos (curva de respuesta con R² > 0,95 para una dosis completa). Sin embargo, a efectos del cribado, puede utilizarse en el an醠isis de las muestras de baja concentraci髇 una curva detallada en los niveles bajos.
• 2.� Para los resultados del bioensayo en un intervalo de tiempo constante, conviene utilizar una concentraci髇 de referencia de TCDD (aproximadamente 3 veces el l韒ite de cuantificaci髇) en una ficha de control de calidad. Otra posibilidad ser韆 utilizar la respuesta relativa de una muestra de referencia comparada con una l韓ea de calibraci髇 de TCDD, habida cuenta de que la respuesta de las c閘ulas depende de m鷏tiples factores.
• 3.� Se recomienda registrar y verificar los gr醘icos de control de calidad (QC) para cada tipo de material de referencia, a fin de garantizar que el resultado es conforme a las indicaciones establecidas.
• 4.� El punto de entrada de la diluci髇 de la muestra utilizada debe situarse en la parte lineal de la curva de respuesta, en particular para los c醠culos cuantitativos. Las muestras situadas por encima de la parte lineal de la curva de respuesta deber醤 diluirse y analizarse de nuevo. Por esta raz髇, se aconseja realizar el an醠isis con tres o m醩 diluciones a la vez.
• 5.� La desviaci髇 t韕ica no debe ser superior al 15 % cuando se lleva a cabo una determinaci髇 en triplicado para cada diluci髇 de la muestra, ni superior al 30 % para tres an醠isis independientes.
• 6.� El l韒ite de detecci髇 podr� fijarse en 3 veces la desviaci髇 t韕ica del blanco de disolvente o de la respuesta de fondo. Otro m閠odo consistir韆 en aplicar una respuesta superior a la respuesta de fondo (factor de inducci髇 5 veces superior al blanco de disolvente) calculada a partir de la curva de calibraci髇 del d韆. El l韒ite de cuantificaci髇 podr� fijarse en 5 a 6 veces la desviaci髇 t韕ica del blanco de disolvente o de la respuesta de fondo o aplicar una respuesta superior a la respuesta de fondo (factor de inducci髇 10 veces superior al blanco de disolvente) calculada a partir de la curva de calibraci髇 del d韆.

7.4 Requisitos espec韋icos aplicables a los bioensayos realizados por medio de kits (2) .

• 1.� Deber醤 respetarse las instrucciones del fabricante por lo que respecta a la preparaci髇 de las muestras y los an醠isis.
• 2.� No deber醤 utilizarse los kits despu閟 de la fecha de caducidad indicada.
• 3.� No deber醤 utilizarse materiales o componentes previstos para otros kits.
• 4.� Los kits deber醤 conservarse y utilizarse en las condiciones de temperatura de conservaci髇 y de utilizaci髇 indicadas.
• 5.� El l韒ite de detecci髇 aceptable para los inmunoensayos se define como 3 veces la desviaci髇 t韕ica, para una serie de diez an醠isis repetidos del blanco, dividido por el valor de la pendiente de la ecuaci髇 de regresi髇 lineal.
• 6.� Conviene utilizar patrones de referencia para los an醠isis de laboratorio, a fin de garantizar que la capacidad de respuesta al patr髇 se sit鷄 en un intervalo aceptable.

8. Notificaci髇 de los resultados

En la medida en que el procedimiento anal韙ico lo permita, los resultados del an醠isis deber醤 incluir los niveles de los cong閚eres individuales de PCDD/F y PCB e indicarse como l韒ite inferior, l韒ite superior y l韒ite intermedio, a fin de incluir el m醲imo de informaci髇 posible en la notificaci髇 de los resultados. Ello permitir� interpretar los resultados en funci髇 de los requisitos espec韋icos.

El informe deber� indicar asimismo el contenido en l韕idos de la muestra, as� como el m閠odo utilizado para su extracci髇.

Deber醤 indicarse los porcentajes de recuperaci髇 de cada patr髇 interno en caso de que dichos porcentajes est閚 fuera del intervalo mencionado en el apartado 6, en caso de que se supere el nivel m醲imo, y en los dem醩 casos cuando se soliciten.

GLOSARIO DE SIGLAS

Espa駉l	Significado	Ingl閟
PCDD	Policlorodibenzo - p - dioxinas.	PCDD
PCDF	Policlorodibenzofuranos.	PCDF
PCB	Policlorobifenilos.	PCB
FET	Factores de equivalencia t髕ica.	TEF
CDD	Clorodibenzodioxina.	CDD
CDF	Clorodibenzofurano.	CDF
CB	Clorobifenilo.	CB
EQT	Equivalentes t髕icos.	TEQ
CV	Coeficiente de variaci髇.	CV